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脉冲瞬态叶绿素荧光仪的研发
郝建卿1 白瑜2 张荣2 郑彩霞1 高荣孚1
1．北京林业大学 生物科学与技术学院植物生理教研组 2．北京雅欣理仪科技有限公司
Schreiber（2004）和 Strasser（2004）的文章代表当前叶绿素荧光仪的主流方向，Walz公司的PAM调制型荧光仪在1986年推出后深受广大研究者欢迎，成为研究叶绿素荧光动力学主流。随后其他一些公司，也陆续推出相应的仪器。非调制的瞬态荧光仪由于电子元件器件和单片机数据采集器等的发展，克服了F0测定问题，在1990年后，以Hansa公司的PEA及有关新的型号为主，顺应了在光抑制和非还原中心的相关研究需要。
近些年来，瞬态荧光技术得到了较大的发展，特别是OJIP（或OKJIP）及其他相关的研究（Stasser 2001）。zui近更由于荧光动力学模型及相关模拟技术的发展，主要以瞬态荧光为基础的（Laisk 等主编Photosynthesis in silico）模拟技术，更使瞬态荧光仪有了新的发展。但是调制荧光仪以F0、Fm、Fm'、F0'和Fs等基本参数为基础可以计算多种荧光动力学参数，仍是当前叶绿素荧光动力学研究的主要内容。同时我们从2005年开始，研究后稳态诱导荧光动力学，有可能进一步发展在后稳态条件下的相关参数。鉴于非调制的瞬态荧光仪相对较简单，结合调制型的饱和脉冲技术，开发了脉冲瞬态荧光仪（Pulse Transition-Fluorescence Meter，商品名Yaxin
一、仪器相关参数
饱和脉冲光强强度范围：0-5000 µmol ·photon ·m-2s-1
光化光光强强度范围：0-2000µmol ·photon ·m-2s-1
采样速率5µs 可变
A/D 12位
二、测定结果
1． 典型瞬态模式测定
该模式下，可得到典型的OJIP的数据，观察到不同光化光强度条件下的OJIP曲线及其相关参数，如图1所示。
图1 不同光化光强度条件下的OJIP曲线
注1：盆栽绿萝放入暗室，暗适应2h后测定不同光化光强度下OJIP的变化。如上图所示，测定强度从上到下一次为3500、3000、2500、2500、2000、1500、1000、500、200、100和50µmol ·photon ·m-2s-1等，光化光持续时间均为10s。
表1 不同光化光强度条件下测得的相应的参数
| 测量项目 | AL（T） | Total Time /s | F0 | Fm | Fv/Fm |
| OJIP | 50（10） | 10 | 7 | 12 | 0.42 |
| OJIP | 100（10） | 10 | 9 | 31 | 0.71 |
| OJIP | 200（10） | 10 | 16 | 81 | 0.8 |
| OJIP | 500（10） | 10 | 39 | 203 | 0.81 |
| OJIP | 1000（10） | 10 | 76 | 417 | 0.82 |
| OJIP | 1500（10） | 10 | 113 | 582 | 0.81 |
| OJIP | 2000（10） | 10 | 149 | 775 | 0.81 |
| OJIP | 2500（10） | 10 | 167 | 971 | 0.83 |
| OJIP | 3000（10） | 10 | 214 | 1124 | 0.81 |
| OJIP | 3500（10） | 10 | 253 | 1423 | 0.82 |
2．脉冲瞬态荧光动力学测定
该模式下可得F0、Fm、Fm'、F0'和Fs五项参数，用于类似调制式荧光仪相关参数的计算。同时可以获得从暗适应后*个饱和脉冲的到的OJIP图形，还能得到第2个脉冲及以后各个脉冲相关变化，即J和P的相关变化。如图2所示。
图2 脉冲瞬态不同光化光强度条件下OJIP曲线
注：盆栽绿萝放入暗室，暗适应2h后进行不同光化光强度下，脉冲瞬态荧光动力学的测量。如上图所示，测定强度依次为50、100、500和1800。测量过程中，饱和脉冲强度设为5000，设置光化光梯度，测量时间为仪器本身设置，饱和光1s，光化光9s，共10s，设置测量时间为300s。300s测量时间结束，开始施加远红光时长4s，黑暗时长1s，接着有个短的饱和脉冲出现获取F0'后，整个测量结束。
表2 脉冲瞬态荧光动力学测定所得的相关参数
| 测量 项目 | SL（T） | （T） | Total Time/S | FR T/S | Dark T/s | F0 | Fm | Fv/Fm | F0' | Fm' | Fs | qP | qN | ΦPSII |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 50（9） | 300 | 4 | 1 | 319 | 1536 | 0.79 | 303 | 1190 | 474 | 0.807 | 0.271 | 0.602 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 100（9） | 300 | 4 | 1 | 273 | 1462 | 0.81 | 271 | 973 | 485 | 0.695 | 0.41 | 0.502 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 200（9） | 300 | 4 | 1 | 361 | 2197 | 0.84 | 354 | 997 | 585 | 0.641 | 0.65 | 0.413 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 300（9） | 300 | 4 | 1 | 383 | 1928 | 0.8 | 360 | 1015 | 604 | 0.627 | 0.576 | 0.405 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 500（9） | 300 | 4 | 1 | 345 | 2161 | 0.84 | 347 | 914 | 593 | 0.566 | 0.688 | 0.351 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 800（9） | 300 | 4 | 1 | 355 | 2100 | 0.83 | 306 | 677 | 530 | 0.396 | 0.787 | 0.217 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 800（9） | 300 | 4 | 1 | 348 | 2205 | 0.84 | 294 | 601 | 525 | 0.248 | 0.835 | 0.126 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 1000（9） | 300 | 4 | 1 | 342 | 2181 | 0.84 | 308 | 678 | 595 | 0.224 | 0.799 | 0.122 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 1500（9） | 300 | 4 | 1 | 324 | 1819 | 0.82 | 285 | 542 | 492 | 0.195 | 0.828 | 0.092 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 1800（9） | 300 | 4 | 1 | 316 | 1907 | 0.83 | 270 | 525 | 487 | 0.149 | 0.84 | 0.072 |
| 脉冲瞬态 | 5000（1） | 2000（9） | 300 | 4 | 1 | 304 | 1880 | 0.84 | 268 | 509 | 478 | 0.129 | 0.847 | 0.061 |
3．后稳态诱导荧光动力学测定
达到稳态后，由于接着再给饱和脉冲、黑暗以及远红光的诱导，所以在光化光诱导下可产生后稳态诱导荧光动力学。如图3 所示。
图3后稳态不同光化光强度条件下OJIP曲线
注：盆栽绿萝放入暗室，暗适应2h后进行不同光化光强度下，后稳态荧光动力学的测量。如上图所示，测定强度依次为50、100、500和1800。测量过程中，饱和脉冲强度设为5000，设置光化光梯度，测量时间为仪器本身设置，饱和光1s，光化光10s，共11s。*个饱和光之前叶片暗适应，然后开始测量，发出*个饱和光，饱和光完成后，施加远红光（4s）、黑暗（1s）、光化光（10s），然后又是一个饱和光，这样就完成了2次测量，即2个饱和光出现过了。本次实验设置了20次测量，整个测量过程中饱和光会出现20次，这20个饱和光中间，隔着远红光、黑暗和光化光，zui后一个饱和光完成后，测量结束。
表3 后稳态荧光动力学测定所得的相关参数
| 测量项目 | SL（T） | AL（T） | Total T | FR Time/s | Dark T/s | F0 | Fm | Fv/Fm |
| 后稳态 | 5000（1） | 50（10） | 20次 | 4 | 1 | 365 | 1909 | 0.81 |
| 后稳态 | 5000（1） | 100（10） | 20次 | 4 | 1 | 356 | 2296 | 0.84 |
| 后稳态 | 5000（1） | 200（10） | 20次 | 4 | 1 | 362 | 1859 | 0.81 |
| 后稳态 | 5000（1） | 500（10） | 20次 | 4 | 1 | 352 | 2024 | 0.83 |
| 后稳态 | 5000（1） | 800（10） | 20次 | 4 | 1 | 382 | 1925 | 0.8 |
| 后稳态 | 5000（1） | 1000（10） | 20次 | 4 | 1 | 372 | 1918 | 0.81 |
| 后稳态 | 5000（1） | 1200（10） | 20次 | 4 | 1 | 357 | 1908 | 0.81 |
| 后稳态 | 5000（1） | 1200（10） | 20次 | 4 | 1 | 338 | 1750 | 0.81 |
| 后稳态 | 5000（1） | 1800（10） | 20次 | 4 | 1 | 325 | 1649 | 0.8 |
| 后稳态 | 5000（1） | 2000（10） | 20次 | 4 | 1 | 246 | 1412 | 0.83 |
4．循环电子传递和线性电子传递相关性的测定
稳态荧光后，如果停止光化光，P680停止电子输出，而P700在远红光继续传递电子，是光合电子进入循环式电子传递，大约需10s或更长一段时间后，突然有光化学诱导使P680发出电子。在这一过程就可以了解电子的情况。如图4所示。
图4 不同远红光时长下OJIP曲线
参考文献
Schreiber U.Chlorophyll Fluorescence: a Signature Photosynthesis.pp279-319. Eds by Papageorgiou G.C., Govindjee. Springer （2004）.
Strasser,R.J. Ibid. Pp 321-362.
试验日期：2011年7月
试验地点：北京林业大学生科院
仪器生产商：北京雅欣理仪科技有限公司
